0  引言

    自英国物理学家RobertHooke首先运用自制显微镜观察到细胞结构以来[1]，现在显微镜已经成为观测微观对象形态、结构、运动和变化的最有力和最常用的工具。但是利用传统的光学显微镜，观测人员只能靠目视进行分析和检验，不但劳动强度大、效率低，而且难以对观测对象进行客观记录和准确的定位定量分析。随着光电检测、计算机和图像处理等技术的发展，数字显微图像处理技术能够达到排除各种主观因素的影响，获得定量的测量数据，更客观地揭示生命活动的规律,因此自20世纪90年代起,逐渐成为国际发展热点。

1  显微细胞图像的研究现状

    采用计算机技术组成的显微细胞图像分析系统是当今国际计算机技术应用中十分热门的课题，尤其是计算机技术发展的速度特别快，加上开发应用的软件功能的不断升级，因此世界各国，包括我国都有一定数量的科研机构、高等院校在从事医学、生物等领域的显微细胞图像分析系统的应用研究，并推出了多种一般性的图像处理分析系统(Image Analysis System , IAS),而专业的图像细胞分析技术(Image Cytometry, ICM)(即专门用于生物组织细胞分子级甚至基因单元的量值化分析研究的技术)从硬件、软件构成到体系结构都要比现在通用的图像处理分析系统复杂得多[2], 而且能代表当今国际ICM技术的、从国际知识产权组织提供的检索报告上只有8份专利技术，即US 1988、US 1989、US l994、EP 1989、EP1995、JP l989、WO 1994和CN1997及24份同族专利．其中CNl997即由中国提交的发明，据悉经实施的产品已作为“九五”国家科技成果重点推广计划指南项目．90年代初，国际ICM的代表产品是美国CAS公司生产CAS―200图像细胞分析系统.但这类系统都是以大型计算机为主机，依赖于专用硬件的支持，使得系统的价格昂贵，在国内医院难以推广应用；又如在流式细胞仪、显微图像分析仪、激光共聚焦显微镜、细胞扫描仪等大型仪器上可进行显微细胞的定量分析，但这些仪器不但依靠进口、价格昂贵，而且数量少、使用不便，只能为少量重点科研项目服务，不可能在临床诊断分析领域广泛推广。
    显微细胞图像的计算机自动分析研究在我国开展较晚，九十年代初时大部分研究人员集中精力在一些新算法的研究上，而忽略了实用系统的研制, 现在随着计算机的速度不断加快，存储空间不断加大，为数字显微图像技术的发展提供了广泛的拓展空间, 国内在图像分析方面，特别是医学病理的显微图像分析已有成功的经验。

2  显微细胞图像处理的基本方法

2.1显微图像处理过程

    显微图像处理的基本过程如下：
    (1)制作切片；
    (2)显微细胞图像采集；
    (3)图像预处理；
    (4)图像分割；
    (5)特征参数抽取；
    (6)统计分析；
    (7)结果输出；

2.1显微细胞图像采集
     通过显微镜将切片放大，成像在摄像器材上，完成光电转换，经A/D转换为数字信号输入计算机。其中摄像器材可采用电荷藕合器件(Charge coupled devices，CCD)照相机、带有视像管(Vidicon)的视频摄像机和扫描仪(Scanners)等。这些器件均称为数字化器，都能将(模拟)电信号转化为数字(离散)的形式(采集流程见图1)。

    在图像采集的过程中，需要注意的是：首先，由于专门针对显微细胞图像，其目标较小，图像采集卡分辨率应该尽可能高，否则，会导致细胞边缘模糊，不利于后期分割处理；其次，显微镜光源的亮度对摄像机摄取病理图像的质量有明显的影响；显微镜光源太亮或太暗所摄取的图像因对比度差、图像不清晰，计算机难以对测试目标进行准确分割，直接影响测量精度。所以调整好合适的显微镜光源的亮度对获取高质量的图像，提高图像测量精度具有重要意义。
完成光学显微图像――数字化显微图像的转换，只是数字化显微图像技术的基础，要得到高质量数字化图像分析效果，好的显微镜和面阵探测器、图像卡、计算机等硬件当然是必要的，然而设计适合的通用或持殊图像处理软件，往往起更大的决定性作用。

2.2图像预处理
    在数字化显微图像系统中，由于图像数字化，以及显微镜、摄像器材等都会存在系统噪声、干扰等等因素，原始图像因为噪声干扰，使图像模糊．难以获取关键的特征信息。因此必须进行除噪处理。显微镜光源亮度不均匀、显微镜光学系统中光束切割、拦截等光学因素、CCD器件光敏面不均匀灵敏度分布等，都会造成数字化显微图像灰度不均匀〔中间亮四周较暗或反之〕。这会直接导致图像区域过饱和或边缘图像模糊。这些缺陷可以通过背景校正或边缘检测算子进行平滑滤波和边缘检测，将这种影响加以限制或消除。
    从根本上说，图像处理的目的，是通过适当软件处理使原始数字图像得到适当变化、以适应人的视觉信息感知和获取特性，更便于或提高图像有用信息的提取。消除噪声影响后，还需进一步提高图像的视觉效果〔图像增强〕、进行阴影校正、改善图像的清晰度、对比度，突出图像的关键特征信息。常用的图像增强处理方法有锐化处理、灰度变换、边缘提取、二值化、反显、伪彩色处理等等，曹茂永[3]等人提出了用Top-Hat算法对细胞进行了突出，以消除光照强度变化对图像的影响。
    针对一般性图像处理问题，可以按具体应用要求灵活地采用一种或多种通用图像处理技术，以及提高图像质量和更有效地获得图像中关键的特征信息。但在实际分析工作(尤其生物医学试样实时显微分析检测工作)中，存在种种特殊的观测对象．提出很不一般的检测要求，因此必须有针对性地设计开发种种特殊图像处理技术。

2.3 图像分割
    细胞图像分割是将图像中需要测量的细胞从背景中分割出来，再用计算机对分割出来的图形进行测定，图像分割的基本要求是分割出来的图形或区域必须与原来的细胞或目标的大小及形态相吻合。因此，图像分割的好坏是决定测量精度的关键因素之一。在通常的情况下，显微细胞目标比例小，背景很复杂，大部分为干扰和噪声，而不同聚焦面上目标灰度又不一致，因而显微细胞图像的分割，显得十分复杂和困难。传统的细胞图象分割技术大致可分为阈值分割、边缘检测、区域生长等几种方法．

2.3.1阈值分割
    通过选择阈值将图像分为目标和背景两大类，阈值的个数可以选择一个或多个，一个阈值称为单阈值分割，选取多个阈值分割称为多阈值方法，且图像将被分割为多个目标区域和背景。阈值分割的优点是算法简单，对于不同类的物体灰度值或其它特征值相差很大时，它能很有效地对图像进行分割，且总能用封闭而且连通的边界来定义不交叠的区域；其缺点是不适用于多通道和特征值相差不大的图像，对于图像中不存在明显灰度差异或灰度值范围有较大重叠的图像分割问题难以得到准确的结果，另外，由于它仅仅考虑了图像的灰度信息而不考虑图像的空间信息，阈值分割对噪声和灰度不均匀很敏感．

2.3.2边缘检测
    边缘检测是通过检测不同区域间的边缘来解决图像分割问题。在区域边缘上的像素灰度值的变化往往比较剧烈，利用相邻区域的像素值不连续的性质，采用一阶或二阶导数来检测边缘点。用微分算子法对图像中灰度的变化进行检测，通过求一阶导数极值点或二阶导数过零点来检测边缘。常用的一阶导数算子有梯度算子、Prewitt算子和Sobel算子，二阶导数算子有Laplacian算子，还有Kirsch算子和Wallis算子等非线性算子。梯度算子不仅对边缘信息敏感，而且对图像噪声也很敏感，因此，通常在求导之前先要对图像进行滤波。边缘检测法的优点是轮廓位置准确，其缺点是不能保证轮廓是封闭和单像素宽的。

2.3.3区域生长
    区域生长的基本思想是将具有相似性质的像素集合起来构成区域，该方法需要先选取一个种子点，然后依次将种子像素周围的相似像素合并到种子像素所在的区域中。区域生长法虽然可以得到封闭轮廓，但是它需要人工交互以获得种子点，这样使用者必须在每个需要抽取出的区域中植入一个种子点；同时，区域增长方式也对噪声敏感，导致抽取出的区域有空洞或者在局部体效应的情况下将分开的区域连接起来；而且区域生长难以确定生长的终止条件，容易产生过分割。
    基于以上方法的局限性，为了更好地达到分割效果，阈值分割和区域生长都很少单独使用，往往是与其它分割方法一起使用。近年来又提出了基于数学形态学的分割方法――水域分割(Watershed变换)法，来对血细胞[4]进行分割。周煦潼[5]等也提出了基于模糊集理论的方法对骨膜显微图像自动分割。

2.3.4存在离焦细胞的显微图像分割
    在对细胞分割算法的论文查阅中，笔者了解到，对于存在离焦细胞的显微细胞图像分割研究工作较少。由于细胞切片的厚度问题，必然存在聚焦细胞和离焦模糊细胞存在于同一图像中。虽然激光共焦显微镜能够克服传统显微镜图像模糊的缺点，但是这种设备由于其硬件系统价格昂贵，而且用激光激发样本时会对样本产生光漂白，因此有必要采取数字图像的处理办法去除原图中模糊的细胞，只留下人们感兴趣的聚焦平面的细胞。

    如图2左所示的显微细胞图像中，最左边的是完全的离焦细胞，中间的细胞右下侧模糊，左半部处于焦平面上，右边的细胞则全部处于焦平面上。由于离焦模糊使得细胞的形态特征差异变小，对基于形态特征的病理分析影响很大，因此笔者从边缘检测的角度出发来识别出处于焦平面上的细胞。

    步骤1.用Sobel算子求出图像的梯度，其阶跃边缘和斜坡边缘（对应焦平面的细胞和模糊的细胞）经过该运算后会得出的不同结果。
    步骤2.选择合适的高斯模板模糊次数对图像进行模糊。
    步骤3.再用拉氏算子求取图像的二阶梯度。
    步骤4.利用非极大值抑制技术求出二阶梯度图象局部梯度幅值极大值点，这些点的集合记为S。
    步骤5.对S中每一点，判断其幅值是否大于阈值T，若大于这留下，小于则从S中删掉。
    图2右所示是该方法的结果。可以看到该方法去除了完全模糊的细胞，保留了焦平面上的细胞。

2.4特征参数抽取
    特征提取是对细胞的定量描述。特征提取和选用是否足以反映细胞类别间的差异，直接影响到分类系统的识别率。形态学特征参数是对细胞形状、大小、轮廓的规则程度的定量描述。光密度特征参数是由于不同类的细胞对光的吸收程度不同，反映在细胞图像的直方图上就对应不同的模式，如灰度偏向、峰谷数多少、峰值大小等。纹理特征因包含着细胞组织表面结构排列的重要信息，而在识别中起重要作用，与其它类特征相比，它能更好地反映细胞图像的宏观与微观结构性质。特征的选取要在细胞学家的指导下进行，才能有效地提取最能代表细胞特征的参数以区分不同种类的细胞。
    再根据已得的特征参数，作出病理判断，或者通过建立人工神经网络对不同的细胞作出分类统计。

3 展望

    显微细胞图象处理系统采用现代光电、计算机多媒体技术．在医用常规显微镜上作非破坏性的技术改造，可实现医学显微图象动态、实时地在计算机屏幕上显示、采集、处理分析等。新一代的显微细胞图象处理技术还应在以下几方面有所改进：

    (1) 提高数字图像采集的清晰度，由于采集到的数字图像的清晰度不够高，导致在进行边界跟踪时，边界走形，复杂度增加而发生错判的缺点。这需要从显微图像处理系统的硬件入手，降低数字化显微图像系统的噪声、干扰和检测误差。
    (2) 进一步发展和完善数字共焦显微技术，以获取的更高分辨率和质量的样本图像。
    (3) 完善现有病理图像分析，尤其在组织细胞的粘连和重叠等图像处理技术上还不完善。在细胞图像分割的分割方面，一直是一个很困难的问题，目前的自动分割方法虽然在一些方面取得了一定的成功，但还远远不能满足显微图像处理的实践中对分割结果准确性的要求。而且对动物的显微病理，尤其是药物作用后细胞组织的变化，目前还无系统的研究。如何针对具体应用领域不同的观测要求，开发设计适用的图像处理技术和信息处理技术，对原始图像进行“加工”、从中“提取”更多符合我们所要求的信息，则是数字化显微图像系统的进一步发展的要求。
    (4)开发针对性强的显微细胞图像分析软件，由于生物学研究和医学临床分析工作中，常常会遭遇一些不同于一般图像处理要求的特殊情况(例如观测对象尺度小于光学显微镜的衍射分辨率、单个微小粒子运动情况追踪，同时要求高时间分辨和空间分辨、染色体图像分割和特征信息提取等)，因此，必须发展针对专门要求的显微图像信息处理技术，并通过实验予以验证。
    综上所述，显微细胞图象处理技术在医学教育、医疗、科研等方面都有广泛的应用前景，也是全世界大力发展的目标，应给予充分的重视和开发。